A Method to Efficiently Cryopreserve Mammalian Cells on Paper Platforms

This protocol describes a simple method to cryopreserve mammalian cells within filter papers as an alternative to conventional slow-freezing approach. The method involves treating paper fibers with fibronectin, using low concentrations of the cryoprotectant dimethyl sulfoxide (DMSO), and slow freezing cells to -80 °C at a 1 °C min-1 rate. In our method, the biocompatibility, large surface area, 3D porosity and fiber flexibility of the paper, in combination with the fibronectin treatment, yield recovery of cells comparable to conventional approaches, with no additional fine-tuning to freezing and thawing procedures. We expect that the paper-based cryopreservation method will bring several advantages to the field of preserving mammalian cells, including accommodation of a higher number of cells within a unit volume and no cell loss after release. The method requires a minimal storage space, where paper platforms with large areas can be rolled and/or folded and stored in stocks, and allows for efficient transportation/distribution of cells in an on-demand manner. Moreover, an additional feature of this method includes the formation and cryopreservation of cellular spheroids and 3D cell cultures., [摘要] 该协议描述了一种简单的方法，可在滤纸中冷冻保存哺乳动物细胞，以替代常规的慢速冷冻方法。该方法包括使用纤连蛋白处理纸纤维，使用低浓度的冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO），然后以1°C min -1的速率将细胞缓慢冷冻至-80°C 。在我们的方法中，纸的生物相容性，大表面积，3D孔隙率和纤维柔韧性与纤连蛋白处理相结合，可产生与传统方法相当的细胞回收率，而无需对冷冻和解冻程序进行额外的微调。我们期望纸质冷冻保存方法这将为保存哺乳动物细胞领域带来几项优势，包括在单位体积内容纳更多数量的细胞，并且释放后无细胞损失。该方法需要最小的存储空间，在该存储空间中，可以将具有大面积的纸平台卷起和/或折叠并存储在库存中，并允许按需方式有效地运输/分配细胞。此外，该方法的另一个特征包括细胞球体和3D细胞培养物的形成和冷冻保存。[背景] 哺乳动物细胞的成功保存，长期保存，维护和分配是​​重要的研究领域，目前仍在深入的科学研究中。特别是，冷冻细胞的及时稳定供应与组织工程研究有关，例如细胞培养，药物开发和测试以及再生和生物治疗医学。 当前的常规细胞冷冻保存方案包括缓慢和快速的冷冻和玻璃化（Pegg，2002； Baust 等，2009）。在这些方法中，将各种浓度的冷冻保护剂添加到细胞悬浮液中，然后以低至1°C min -1 （慢速冷冻）至高至120°C min -1 （快速）的温度冷却介质。冷冻），或将样品直接放在-195°C液氮罐中（玻璃化）。结果，由于具有冷冻保护剂的保护作用，在冷冻过程中细胞的损伤或死亡被最小化（Karlsson和Toner，1996； Asghar 等，2014； Jang 等，2017）。然而，这些方法在需要大的存储空间以将细胞容纳在成千上万个小的冷冻管和冷冻袋中方面具有局限性（Heidemann 等，2010； Massie 等，2014）。然后，细胞的分布面临着损失，识别错误和物流管理方面的挑战（Tomlinson，2005 ）。 最近的方法描述了使用各种工程多孔支架进行细胞组织构建物的冷冻保存。示例包括使用玉米淀粉-聚己内酯纤维网（Costa 等人，2012），静电纺丝-聚氨酯纳米纤维片（Batnyam 等人，2017），藻酸盐-明胶冷冻凝胶海绵（Katsen-Globa 等人，2014），以及网状聚乙烯醇缩甲醛树脂（Miyoshi et al。，2010）。这些研究的结果证明，支架的生物相容性，机械支持和3D孔隙度在为细胞冷冻保存创造保护性微环境时提供了适当的平衡。然而，对于这些支架，需要针对与细胞的冷冻保存相关的用途重复制造（即，工程化）基质，这给该领域带来了很大的障碍。 值得注意的是，基于纸的平台已成为组织工程开发，尤其是3D细胞培养的有吸引力的替代方案。这些现成的支架具有成本效益和可调节的纤维表面特性等附加功能，为大规模，多层生物测试提供了出色的适用性（Derda 等，2009； Mosadegh 等，2014）。结果，已经广泛地研究了利用纸平台的各种蜂窝应用（Ng 等，2017； Wu 等，2018； Rosqvist 等，2020）。然而，尽管纸平台作为3D细胞培养和分子采样的基质具有巨大潜力，但直到我们最近的工作（Alnemari 等人，2020年）之前，纸平台从未被充分利用来直接冷冻保存细胞。取而代之的是，它被用作玻璃化容器（2D纸质基材）以增强小鼠胚胎（Paul 等人，2018），牛卵母细胞（Kim 等人，2012）和牛胚泡（Lee 等人，2013 ）的冷冻保存。）。另一方面，FTA卡用于核酸的收集，存储（在室温或+4°C，-20°C和-80°C下），运输和分子分析（Santos，2018）。 在此协议中，我们给出了有关如何使用我们开发的基于纸张的冷冻保存方法（Alnemari 等，2020）对3D保存和释放哺乳动物细胞进行分步说明（图1 ）。该技术始于切割滤纸切成小条带（例如，3 ×3cm的2 ）。然后，用纤连蛋白处理纸纤维以增强解冻后细胞的释放。这是通过将细胞悬浮在含有低浓度二甲基亚砜（DMSO）的血清培养基中来进行的。随后，将细胞悬浮液吸移到纤连蛋白处理的纸上。细胞渗入纸张的3D多孔基质后，立即将其卷起并放入标准冷冻管中，以1°C min -1的速率缓慢冷冻至-80°C ，并长期保持在-195°C液氮中储存。然后可以将细胞融化，并根据需要从纸中释放出来以在烧瓶中以典型的2D培养物形式进行扩展，或者保存在纸中以以3D培养物和类球体的形式生长。 在开发的方法中，细胞在纸张的3D多孔环境中无处不在，其中纸张纤维在冷冻保存期间提供了自然的保护和支持环境。结果，融化后的细胞通过轻轻摇动纸，以高存活率有效地从纸上释放。在此，可以通过简单地优化纤连蛋白浓度以有效释放细胞来使用具有适合细胞穿透的孔的任何类型的纸张。该论文还为论文中的其余细胞以聚集体（球状体）的生长提供了通用的环境，并且还成功地实现了3D细胞培养物的形成（通过使用Matrigel基质）和冷冻保存（Alnemari 等人，2020）。。纸基冷冻保存以节省成本，快速且易于管理的方式提供节省空间和有效的细胞运输/分配解决方案，因为可以卷起和/或折叠大纸张以适合标准冷冻管（或其他容器））并储存在库存中并切成小块，无需解冻整个平台。图1. 纸基细胞冷冻保存方法。一。纸质冷冻保存方法所涉及的阶段概述。解冻后，可以通过轻轻摇动将细胞从纸中释放出来，并在烧瓶中以2D培养物的形式扩增，或者根据需要在体外进行3D培养。乙。显微照片可视化处理3×3 cm 2的纸带并在滚动后将其放置在冷冻管中的方式。